一.ELISA標準操作要點(diǎn)
的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導率小于1.5μs/cm。
1.標本的采取和保存
大部分ELISA檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時(shí)會(huì )釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時(shí)檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性反應。一般說(shuō)來(lái)，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(cháng)導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過(guò)一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測。反復凍融會(huì )使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應注意無(wú)菌操作，也可加入適當防腐劑。
抗凝不*的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。
2.加樣
加樣時(shí)應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。
3.保溫
在建立ELISA方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)
1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時(shí)間應按規定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(huì )造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會(huì )偏高，建議為了客觀(guān)的判斷結果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。
4.洗滌
洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應步驟，但卻決定著(zhù)實(shí)驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來(lái)達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
洗板時(shí)注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋?zhuān)瑧匆笙♂專(zhuān)玫乃妼试?.5us/cm之下，洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時(shí)間為40秒左右，孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。
5.顯色和比色
TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(cháng)（450nm）測讀吸光值。酶標比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標儀，通常指于測讀ELISA結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、度和可測范圍、線(xiàn)性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數一般可到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽(yáng)光或強光照射下，操作時(shí)室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩定。
測讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(cháng)。有的酶標儀可用雙波長(cháng)式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長(cháng)（W1），第二次在不敏感波長(cháng)（W2），兩次測定間不移動(dòng)ELISA板的位置，zui終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長(cháng)式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
二.本底及假陽(yáng)性產(chǎn)生的原因分析
1.基因工程抗原與合成肽抗原的區別
1.1基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統。該類(lèi)抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：
a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到數百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。
b.穩定性好。包被的抗原的穩定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4個(gè)月，采用基因工程抗原后效期大大延長(cháng)了。
c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。
d.純化難度大。基因工程抗原的純化技術(shù)難度較大。
1.2合成多肽抗原是根據蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)：
a.分子量太小
b.一般只含有一個(gè)抗原決定簇
c.純度高
d.穩定性差
由于基因工程抗原較于合成肽抗原有*的*性，ELISA診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過(guò)渡。就HCVELISA試劑盒來(lái)講，*代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了HCV的核心區片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩定、純度更高的HCV特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。
由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來(lái)衡量ELISA反應試劑盒，因此有些為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類(lèi)試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩定性也成問(wèn)題。值得欣慰的是也有堅持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)得對待反應結果。
2．假陽(yáng)性本底產(chǎn)生的原因
2.1抗原因素
2.1.1融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來(lái)自表達載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應而產(chǎn)生了可疑標本。
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